NY_T 2678-2015 马铃薯6种病毒的检测 RT-PCR法
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ID： |
51CFD720B67E447DB14768E100A35FA9 |
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文件大小(MB)： |
0.69 |
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12 |
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日期： |
2024-8-14 |
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ics 65.020.01,B 15 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2678-2015,马铃薯6种病毒的检测 RT-PCR法,Detection of the six potato viruses—RT-PCR method,2015-02-09 发布2015-05-0I 实施,中华人民共和国农业部发布,ny/t 2678—2015,刖 百,本标准按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草,本标准由农业部种植业管理司提出并归口,本标准起草单位:农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、湖南农业大学园艺学,院、华中农业大学生命科学技术学院、福建农林大学,本标准主要起草人:张威、白艳菊、李学湛、柳俊、詹家绥、聂碧华、胡新喜、何长征、高艳玲、范国权、,申宇、张抒、王晓丹、王文重、魏琪、邱彩玲、耿宏伟、董学志、万书明,I,NY/T 2678—2015,马铃薯6种病毒的检测RT- PCR法,1范围,本标准规定了马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯X病毒(Po皿。virus X,PVX)、马铃薯,M 病毒(Potato virus A1,PVM)、马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y, PVY)、马铃薯卷叶病毒leafroll,vシ〃s ,PLRV)和马铃薯A病毒(Potato virus A, PVA)的反转录聚合酶链式反应(RT - PCR)分子,生物学检测方法(见附录A),本标准适用于马铃薯试管苗、原原种和田间马铃薯块茎、植株等组织中病毒的检测,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件,GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法,3原理,本标准采用反转录ー聚合酶链式反应(reverse~transcription polymerase chain reaction, RT PCR),方法检测马铃薯病毒。其原理是,将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的,技术,RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA,再以cDNA为模板,在Taq DNA聚合酶的作用下进,行PCR扩增,根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段,从而达到鉴定病毒的目的,4试剂和材料,以下所有试剂,除非另有规定仅使用分析纯试剂,水为符合GB/T 6682中规定的ー级水,4. 1 TRIzol RNA提取试剂,4.2 三氯甲烷,4.3 异丙醇,4.4 75%乙醇,量取无水乙醇?5 mL,加水定容至100 mL0,4.5 M-MLV 反转录酶(200U/L),4.6 RNA 酶抑制剂(40U/L),4. 7 Taq DNA 聚合酶(5 U/L),4. 8 10 X PCR buffer (Mg2+ free),4.9 MgCI2(25mmoI/L),4. 10 dNTP 混合物(各 2. 5mmol/L),4. 1I焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水,在100 mL水中,加入焦碳酸二乙酯(DEPC) 50Kし室温过夜,121℃高温灭菌20 min,分装到,1. 5 mL DEPC处理过的离心管中,4. 12 10XTAE电泳缓冲液,羟基甲基氨基甲烷(Tris)242 g,冰乙酸57. 1 mL,乙二胺四乙酸二钠?2H2O 37. 2 g,用氢氧化钠调,pH至8. 5,加水定容至1 000 mLo,1,ny/t 2678—2015,4. 13 1X TAE电泳缓冲液,量取10X TAE电泳缓冲液(4. 12)100 mL,加水定容至1 000 mLo,4. 14漠化乙锭溶液(10mg/L),称取澳化乙锭200 mg,加水溶解,定容至20 mLo,4. 15 1.5%琼脂糖凝胶板,称取琼脂糖1. 5 g,加入1XTAE电泳缓冲液(4. 13)定容至100 mL,微波炉中加热至琼脂糖融化,待溶液冷却至50℃.60℃时,加澳化乙锭溶液(4. 14)5kし摇匀,倒入制胶板中均匀铺板,凝固后取下,梳子,备用,4. 16引物缓冲液,用DEPC水将上、下游引物分别配制成浓度为!00 ng/ML的水溶液,4. 17 100 bp DNA分子量标准物,4. 18阳性对照,参见附录B中B. 1,4. 19阴性对照,参见附录B中B. 2,5主要仪器,5. 1 PCR 仪,5.2台 式低温高速离心机,5.3电 泳仪、水平电泳槽,5.4凝 胶成像仪,5. 5 微量移液器(0. 5 L-10 Lao L—100 L、20 L-200 L、100 L~1 000 L) 0,5.6灭菌锅等,6操作步骤,6. 1对照的设立,实验分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照(即用等体积的DEPC水代替模板RNA做空白对,照),在检测过程中要同待测样品一同进行如下操作,6.2样品制备,取马铃薯试管苗、块茎芽眼及周围组织或茎叶组织0. 05 g~0.1 g,现用现取或条件下保存,最,多存放3丸,6. 3 RNA提取,将样品置于研钵中,加液氮研磨成粉末,转至!. 5 mL离心管,加入1 mL TRIzol混匀,使其充分裂,解;4℃ 14 000 g离心5 min;取上清,加入200心三氯甲烷,振荡混匀,室温放置15 min；4℃ 12 000 g离,心15 min；吸取上层水相至新1.5 mL离心管中,加入0. 5 mL异丙醇,混匀,室温放置10 min； 4℃,12 000 g离心10 min;弃上清,留沉淀,加入1 mL 75%乙醇,温和振荡离……
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